基因实时荧光定量PCR全面解决方案

 
实时荧光定量PCR( realtime fluores-cence quantitative PCR，RT-qPCR )，是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。由于荧光定量PCR具有高特异度、高灵敏度、高重复性，是科研、疾病诊断常用技术手段。
一、技术路线


二、技术方法
2.1 样本基因组提取
2.1.1RNA提取

1. 所需样本量：细胞（≥10⁶）、组织（≥300mg）、血液（≥2ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，总RNA（≥20μl，浓度≥ 50ng/μl）。
2. 样本保存：组织样本请保存在-80ºC或保存在Trizol中（液氮研磨后）或保存在RNAlater中（动物组织）
3. 样品运输：用冻存管保存，并用干冰或液氮运输。

相关技术服务
服务项目	内容说明
RNA提取	从血液、组织、叶片等样本材料中提取总RNA
血清RNA提取	从1-5ml血清中提取总RNA
石蜡包埋组织RNA提取	从石蜡包埋的组织块中提取总RNA

2.1.2DNA提取

1. 所需样本量：细胞（≥10⁶）、组织（≥300mg）、血液（≥2ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，总DNA（≥20μl，浓度≥ 50ng/μl）；
2. 样本保存：组织样本请保存在-80ºC；
3. 样品运输：用冻存管保存，并用干冰或液氮运输。

相关技术服务
服务项目	内容说明
DNA提取	从血液、组织、叶片等样本材料中提取总DNA
血清DNA提取	从1-5ml血清中提取总DNA
石蜡包埋组织DNA提取	从石蜡包埋的组织块中提取总DNA

2.1.2样本质量检测
如果客户给的样本是已提取好的总RNA样本，需满足以下条件：

1. 完整性：1.2%琼脂糖凝胶电泳出现两条带（28s、18s RNA），其中28s RNA条带的亮度是18s RNA条带亮度的1.5～2.0倍，否则说明RNA出现了降解。如果出现弥散片状或者条带缺失，则说明RNA样本出现严重降解，说明样本不可用；
2. 纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8～2.1之间，比值最好为2.0（保存液为pH=7.0 的RNase free ddH2O）。DNA 应该去除干净；
3. 浓度：最低浓度不低于200ng/μl，每个样品总量不少于10μg；
4. 保存条件：要溶解在H₂0或TE (pH 8.0)，用冻存管保存，并用干冰或液氮运输;。

注：建议在条件允许情况下，提供可供两次样品制备的量，以确保实验质量及延续性。
2.1.3原则性要求
 （1）请提供新鲜材料，总量越多越好；
 （2）请提供已知的全长基因序列；
 （3）请提供尽可能详细的背景资料，如DNA/RNA来源等。
2.2反转录
   mRNA的cDNA第一链合成方法：

1. 普通RNA模板
2. 二级结构复杂的RNA模板（由我公司技术工程师鉴定）

2.3 荧光定量检测

1. SYBR Green I法
2. Taqman探针法

2.4 实验结果分析

1. 相对定量
2. 绝对定量
3. 分析点突变和等位基因
4. DNA甲基化检测
5. 单核苷酸多态性（SNP）分析

三、实时荧光定量平台及参考报价
 

实时荧光定量平台	服务内容	价格
样本抽提	抽提RNA	70元/样
	抽提DNA	50元/样
引物、Taqman探针设计及合成	引物设计及合成	100元/基因
	Taqman探针设计及合成	1000元/基因
逆转录	RNA反转录成cDNA	50元/样
预实验（荧光定量体系优化）	确定荧光定量PCR最优条件	300元/基因
标准品制作	绝对定量分析必须制备	500元/基因
荧光定量检测	目的基因、内参基因	50元/反应
实验数据分析	分析实验数据，得出结论	免费

四、完成时间
2个星期，（视样本量大小而定）

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