miRNA实时荧光定量PCR全面解决方案

 
microRNAs(miRNAs)是一种内源性非编码RNA，它的产生和成熟需要一系列因子的参与。最早从基因中转录出的是miRNA转录本（pri-miRNAs），被RNase III剪接加工生成70至100个核苷酸的发夹前体（Pre-miRNAs），然后从细胞核转移到细胞质中，Pre-miRNAs被另一个类似于RNase III的Dicer酶加工，生成长度平均为21-23nt的成熟miRNAs。 作为生命活动重要的调控因子，microRNAs（miRNAs）在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。

一、技术路线


二、技术方法

2.1 样本miRNA提取
所需样本量：细胞（≥10⁶）、组织（≥300mg）、血液（≥2ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，总RNA（≥20μl，浓度≥ 50ng/μl）；
样本保存：组织样本请保存在-80ºC或保存在Trizol中（液氮研磨后）或保存在RNAlater中（动物组织）；
样品运输：用冻存管保存，并用干冰或液氮运输。
 

相关技术服务
服务项目	内容说明
RNA提取	从血液、组织、叶片等样本材料中提取总RNA
血清RNA提取	从1-5ml血清中提取总RNA
石蜡包埋组织RNA提取	从石蜡包埋的组织块中提取总RNA
miRNA提取	从细胞、血液、组织、叶片等多种样本材料中（石蜡包埋组织样本除外）提取是small RNA(<200nt)，miRNA纯度、丰度更高。

2.2 样本质量检测
如果客户给的样本是已提取好的总RNA，需满足以下条件：

1. 完整性：1.2%琼脂糖凝胶电泳出现两条带（28s、18s RNA），其中28s RNA条带的亮度是18s RNA条带亮度的1.5~2.0倍，否则说明RNA出现了降解。如果出现弥散片状或者条带缺失，则说明RNA样本出现严重降解，说明样本不可用；
2. 纯度：OD260/OD280在1.8~2.1之间，比值最好为2.0（保存液为pH=7.0 的RNase free ddH2O）。DNA 应该去除干净；
3. 浓度：最低浓度不低于200ng/μl，每个样品总量不少于10μg；
4. 保存条件：要溶解在H₂0或TE (pH 8.0)，用冻存管保存，并用干冰或液氮运输;。

注：建议在条件允许情况下，提供可供两次样品制备的量，以确保实验质量及延续性。
2.3反转录
   miRNA的cDNA第一链合成有两种方法：

1. 加尾法
2. 茎环法

2.4 荧光定量检测

1. SYBR Green I法
2. Taqman探针法

三、实时荧光定量平台及参考报价

实时荧光定量平台	服务内容	价格
miRNA提取	细胞、血清、组织等一般样本	100元/样
	石蜡包埋组织样本	150元/样
	高纯度富集miRNA提取	300元/样
miRNA 反转录	加尾法	1000元/样
	茎环法	2000元/基因
特异性引物设计及合成	特异性引物设计及合成	500元/基因
荧光定量PCR	50微升体系	50元/反应
实验数据分析		免费

四、完成时间
2周，（视样本量大小而定）
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