磷酸钙法高效转染试剂盒（HET）

Ø  百恩维公司生产研发的高效转染试剂盒（HET）可有效地转染各种哺乳动物细胞，通常293细胞转染率很容易达到40-50%，优化条件后更能高达90%以上。并且对细胞基本没有毒性。不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定细胞株。

Ø  质粒DNA, DNA, siRNA 等均可使用。

Ø  可用于转染的细胞包括各种细胞株（如HEK293，NIH3T3，COS7等）和原代细胞（如成纤维细胞，成肌细胞，间充质干细胞，角质细胞，内皮细胞，上皮细胞等）。

Ø  转染前以细胞融合度不超过80%为宜。接种密度因所采用的细胞系和细胞的倍增时间而有所不同。一般而言，细胞的接种密度为3～5 × 10⁶ cells/100-mm培养皿，1～2×10⁶ cells/60-mm培养皿或6孔板中为6～8 ×10⁵ cells/孔。

Ø  本试剂盒可转染六孔板细胞1000次，每孔成本5毛钱，性价比非常高。

Ø 本试剂盒提供的试剂都经无菌处理，并通过严格质量检验，可以直接使用。

本试剂盒可在室温（15～25℃）保存三个月，4℃保存一年，-20℃保存一年以上。

1.       使用前预热试剂至常温。

2.       转染前一天，接种适量细胞悬液至100-mm培养皿、60-mm培养皿或6孔板中，放置到潮湿37°C 5% CO₂ 培养箱培养过夜。

3.       次日，吸去细胞培养液，加入新鲜培养液（不含青霉素-链霉素）。

4.       取两根无菌1.5ml eppendorf管，分别记为A、B。按下表，根据培养皿不同而加入不同体积的试剂：

100-mm 培养皿 （含5ml培养基）	60-mm 培养皿 （含2.5ml培养基）	6孔板 （含1ml培养基）
A管：500μl Buffer A	A管：250μl Buffer A	A管：50μl Buffer A
B管：50μl Buffer B 10~100μg DNA 无菌水补足体系至500μl	B管：25μl Buffer B 5～50μg DNA 无菌水补足体系至250μl	B管：5μl Buffer B 1～10μg DNA 无菌水补足体系至50μl

5.       用移液管混匀B管中溶液并将B管中溶液轻轻逐滴加入到A管中。用气泡法混匀转染混合物，这一步尽量在2分钟内完成，室温孵育30分钟。

6.       将混合物逐滴加入到细胞中，轻轻摇晃培养皿使混合物均匀分布在细胞表面。

7.       放置到潮湿37°C、5%CO₂培养箱中培养过夜。

8.       次日早上用新鲜培养基更换细胞培养液，于37℃ 5%CO₂培养箱中继续培养24-48h。

9.       检验转染效率（如荧光观察，蛋白质印迹等）。

注意事项：
       高纯度的质粒是获得高转染效率的必要条件，要确保A260/A280大于1.8，并且电泳检

测抽提到的质粒90%以上都是超螺旋。

转染时，B管中溶液轻轻逐滴加入到A管中，请勿混乱顺序。
       溶液的pH值关系到转染效率，尽量避免把转染试剂盒的溶液长时间暴露在空气中，以免被空气中的二氧化碳酸化。
       转染时由于质粒不同、细胞不同，最佳的质粒用量需自行摸索。
       为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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