scfv抗体噬菌体展示流程

 1.什么是scfv抗体文库

噬菌体展示文库是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用以筛选特异性蛋白或多肽的一项新技术。

Single-chain Fv（scFv）片段由抗体的最小功能性抗原结合结构域 (~30 kDa) 组成，其中可变重链 (VH) 和可变轻链 (VL) 通过肽接头连接在一起。抗体文库是指将抗体的可变区（VH和VL）基因，尤其是CDR区域（互补决定区）采用不同的策略和方式，如氨基酸突变，移码读框等形成数目庞大的不同克隆，并从这些克隆中筛选出针对目的抗原的高亲和力单链Fv抗体。

3.scfv抗体文库优点

ScFv 片段保留了亲本抗体的结合特异性，与全长 mAb 相比具有多项优势。

（1）具有药代动力学特性，例如更好的组织渗透和快速的血液清除，有利于放射治疗和诊断应用。与完整抗体相比，这些片段可以更快地渗透到肿瘤中；当 scFv 在放射治疗应用中与放射性核素结合时，它们从血液中清除率增加最大限度地减少了健康组织的暴露。

（2）重组抗体缺少 Fc 区，导致免疫原性低，因此与全长 mAb 相比，它们在许多应用中成为更好的治疗剂。

（3）scFv 可以在细菌和哺乳动物细胞中克隆和表达，从而可以轻松且经济高效地大量生产。

4.scfv抗体文库应用

scfv抗体在人类生命科学发展历程中发挥着重要作用。例如作为工具研究蛋白质功能 ，癌症治疗，由于尺寸较小可以与量子点、纳米粒子结合，可以进入体内定位目标，作为运载药物/纳米粒子的载体等。

5.卡梅德生物能够为客户提供高质量的scfv抗体噬菌体展示服务

卡梅德生物（KMD Bioscience）多年来致力于抗体领域研究。我们积累了丰富的抗体文库构建经验，能够为客户提供基于抗体噬菌体展示文库技术的single-chain Fv（scFv）抗体文库构建服务，可以制备得到高亲和力，结构稳定的scFv抗体。

6.卡梅德生物为客户提供scfv抗体文库构建服务的全流程介绍

卡梅德生物为客户提供噬菌体文库构建服务，流程包括：抗体cDNA制备，基因扩增，载体构建，电击转化，抗体鉴定，scfv文库包装。

6.1抗体cDNA制备

6.1.1总RNA提取

将外周血淋巴细胞从冰箱取出后分装，加入氯仿，离心后取上清加入异丙醇，离心保留沉淀，加入75%乙醇后离心保留沉淀，干燥后加入DEPC水，孵育确保RNA溶解，将各管混合到一管中即为总RNA，取1μl总RNA进行电泳，取2μl用核酸浓度测量仪测浓度。

6.1.2反转录获取cDNA

按照商业化试剂盒操作说明书进行cDNA制备，将上一步得到的RNA一分为二反转录成cDNA，反转录引物分别用Oligo dTprimer及random 6-mers。

6.2 基因扩增

首先，以cDNA为模板扩增VH和VL(Vκ/Vλ)链可变区，进行两轮PCR扩增。PCR反应（每个50µl）包含2µlcDNA (40 ng/µl)、1µl正向引物 (10µM)、1µl反向引物 (10µM)、0.5µl Q5 DNA 聚合酶, 1µl dNTP 混合物 (10µM) 和34.5µl dd H₂O.然后，回收 PCR 产物。最后，通过重叠 PCR 连接 VH 和 VL 接头。

6.3载体构建

PCR扩增产物scFv通过酶切连接到噬菌体质粒pADL-10b中，从而构建含有扩增片段的噬菌体质粒库。将连接产物使用DNA纯化回收试剂盒按说明书回收，分别取2μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度。

6.4电击转化

6.4.1将连接产物进行电击转化后构建含有目的抗体片段的大肠杆菌文库。

取SS320大肠杆菌感受态细胞，加入回收后的连接产物，将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷好的电转杯中，使用电转仪预设的转化程序电击转化，电转后立即往电转杯中加入950μlSOC培养基，至少进行20个电转。将细胞复苏后涂在含有氨苄抗性的琼脂糖培养板上过夜生长。将上一步过夜生长后的培养板上的细胞用2xYT培养基和涂布棒冲洗刮下，加入20%的甘油测OD600nm值后保存在-80℃，即为细菌文库。

6.4.2噬菌体文库扩增

将上一步刮下的菌体混匀后转移到100 mL预先加入四环素的2x YT培养液中，37℃，250rpm培养直至OD600nm达到0.5-0.55。

按照辅助噬菌体：细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体后继续37℃培养30分钟。加入终浓度为50µg/mL的Kana和终浓度为0.2mMI PTG，30℃过夜摇床培养。

6.4.3噬菌体文库制备

将过夜培养的细菌4℃ 4000 rpm离心20分钟，将上清转移到新的离心管后加入1/4体积预冷的的20％PEG/2.5M NaCl，在冰上孵育30分钟。4℃ 4000 rpm离心20分钟去除上清后加入1 mL PBS缓冲液溶解沉淀。再次加入1/4 体积预冷的20％PEG/2.5M NaCl后冰上孵育10分钟，4℃ 12000 xg离心10分钟后去除上清并将沉淀溶解在1 mL PBS中得到噬菌体库，长期-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存。

6.5抗体鉴定

随机挑选20-50个克隆，PCR鉴定阳性率，测序和分析抗体序列。

6.6 scfv文库包装

交付＞1x10¹³噬菌体颗粒/ml。

自 1988 年推出以来，scFv 在临床前和临床应用以及研究实验室中变得高度相关。抗体工程的进步使高度定制的 scFv 的产生成为可能，这些 scFv 具有改善药代动力学的特性，使其更具临床相关性。将这些重组抗体与不同粒子偶联，扩大了它们在诊断、治疗和体内成像应用中的潜力。卡梅德生物致力于噬菌体文库展示技术多年，拥有M13，T4，T7多种展示系统，构建的scfv噬菌体文库库容量高，独立克隆数10⁷-10¹²，根据客户需求制备，为每一个客户量身定制实验方案。